? ? ? 近日,南方科技大學生物醫學工程系先進顯微成像課題組李依明團隊在三維全細胞大視場高通量超分辨成像領域取得重要進展,相關研究成果以 “Field-dependent deep learning enables high-throughput whole-cell 3D super-resolution imaging”為題在國際頂級期刊Nature Methods上長文發表。 ? ? ? ?具有高對比度和超分辨率的熒光顯微鏡徹底改變了細胞生物學研究。此外,生物醫學研究通常需要大量的統計分析才能得出具有高置信度的結論,具有豐富信息內容的高通量成像被廣泛應用于定量生物學研究。一個新興的趨勢是發展用于高內涵篩選的高通量超分辨顯微成像技術。基于寬場成像的單分子定位超分辨顯微成像技術(single-molecule localization microscopy, SMLM),將光學分辨率提升一個數量級以上,理論上通過使用大面陣探測器就可以在不損失分辨率和速度的條件下,提升成像通量。然而,視場相關的像差通常將SMLM有效的成像區域局限在幾十微米的尺度。傳統的大視場超分辨成像需要多區域拼接完成,效率非常低下,限制了其對大尺寸樣品進行高通量成像。 ? ? ? ?研究團隊提出了一套針對空間移變點擴散函數(point spread function, PSF)精準定位的深度學習算法框架FD-DeepLoc(field dependent deep learning localization)。該框架集成了一套基于GPU加速的矢量PSF全局擬合算法和利用時空信息進行移變單分子定位的深度學習神經網絡,在180×180×5 μm3范圍內實現了無需掃描的全細胞超分辨成像,將三維SMLM的成像通量提升了約100倍(DOI :10.1038/s41592-023-01775-5)。該工作為超分辨顯微成像領域提供了新的技術思路和視角,對研究完整細胞群或組織中納米級生物結構具有重要的理論意義和應用價值。 ? ? ? ?為了對大視場中的移變PSF進行精確建模,團隊從適用于高數值孔徑物鏡的矢量PSF建模出發,構建了一套可描述任意位置像差的空間移變PSF模型。結合團隊之前發表在Nature Communications的全局擬合算法globLoc對不同z平面的點光源圖片進行全局擬合,實現對像差的高精度估計[1]。考慮到建模整個大視場空間移變的像差(21項澤尼克多項式系數表示)需要對整個視場進行上千次的采樣,而基于矢量衍射德拜積分理論建立的PSF模型的計算涉及到多次傅里葉變換,計算量非常大。為了加速這一過程,團隊開發了領域內第一個基于GPU加速的矢量PSF模型擬合算法和像差校正軟件,將校正速度提高了50倍,滿足了大視場的PSF建模需求。 ? ? ? ?近年來,深度學習算法已被廣泛應用于科學研究中。憑借出色的特征感知能力和端到端的圖像擬合能力,深度學習在SMLM中展現出遠超傳統算法的性能,尤其是對于分子高度重疊的情況。傳統的卷積神經網絡對圖像中不同的區域使用的是同一個卷積核,對空間位置不敏感。當目標與其空間坐標解耦時,卷積神經網絡往往能在目標識別中表現優異。然而,光學像差通常是靜態的并且與其位置高度相關。對于大視場成像,需要空間位置敏感的超分辨重建算法。為了克服視場相關的像差,團隊在卷積神經網絡中引入兩個位置相關的通道,卷積核在卷積單分子圖片的時候,也對這兩個位置通道進行卷積,從而把位置相關的信息編碼到神經網絡里(圖1)。FD-DeepLoc突破了傳統卷積神經網絡對空間位置不敏感的局限,在全畫幅sCMOS相機(1608×1608)視場范圍內對空間移變的單分子數據精準定位,實現了三維大視場高通量超分辨成像。 圖1?FD-DeepLoc網絡框架圖 ? ? ? ?深度學習算法通常需要先驗知識對網絡進行訓練。在FD-DeepLoc網絡中,通過精確建模物理成像過程生成海量數據,有效避免了深度學習過擬合的問題。此外,FD-DeepLoc唯一的先驗就是PSF模型,不需要預先知道生物樣品的結構信息,所以無需對不同的樣品重復訓練網絡。考慮到校準系統PSF時存在測量誤差以及樣品自身引入的像差,FD-DeepLoc采用魯棒訓練策略,對PSF模型中的像差引入先驗分布,同時將不均勻背景建模為柏林噪聲,利用上述訓練數據得到的網絡表現出更好的魯棒性和精確率。在模擬和實驗數據中(圖2),FD-DeepLoc相對于目前領域內兩個表現最好的算法——團隊2018年在Nature Methods上發表的基于三次樣條插值的傳統單分子擬合Cspline算法[2]和基于神經網絡的DECODE算法[3],都有顯著的提升。在三維超分辨定位精度指標均方根誤差(root-mean-square error, RMSE)上相比于DECODE提升近兩倍。此外,FD-DeepLoc包含的大視場空間移變的矢量PSF建模和基于深度學習的單分子定位算法提供開源(https://github.com/Li-Lab-SUSTech/FD-DeepLoc)。 圖2 FD-DeepLoc用于分析大視場下核孔復合物實驗數據 ? ? ? ?大視場成像可以用來對大尺寸樣品進行研究。體外培養神經細胞通常都在幾百微米的范圍內生長,傳統的超分辨成像一般只能看到小于50 μm的軸突片段,往往忽略掉一些不常見的結構,而且無法在更大的尺度上觀測神經元之間的精細互作信息。研究人員利用小鼠胚胎干細胞誘導的神經細胞,選用β2血影蛋白作為觀測對象。利用傳統散光調制的PSF進行三維超分辨成像(圖3a-e),血影蛋白沿神經突的周期性組織清晰可見。然而,傳統散光PSF的景深有限,難以對哺乳動物5-10μm典型細胞厚度進行全細胞成像,圖3d由于重建的超分辨圖像景深受限在1?μm左右,離焦處的神經突結構有部分圖像丟失。 圖3 β2血影蛋白在神經細胞中的三維超分辨成像。比例尺,50 μm (a,f),10 μm(d),1 μm(b,c,g–j) ? ? ? ? ?為了拓展軸向成像范圍,通常對光瞳函數進行調制得到不同形狀的PSF來對不同景深范圍的樣品進行成像。傳統的大景深PSF往往需要復雜的光瞳函數實現,需要用到高像素的空間光調制器。然而,空間光調制器對偏振敏感,用來對熒光信號進行成像會損失一半的光子數。與空間光調制器相反,可變形鏡對光子數的利用率比較高,但是能控制的促動器數量較少。為了能精確獲得可變形鏡調制的光瞳函數,團隊提出了一種以可變形鏡促動器響應函數為基函數的相位設計框架[4],優化得到了一系列基于可變形鏡的三維精度最優PSF(DM-optimized PSF, DMO PSF)。DMO?PSF可實現自由景深控制,顯著提高了SMLM的圖像質量(圖4)。對于神經細胞的成像實驗,采用可變形鏡優化的3μm景深DMO PSF進行數據采集,即使在具有大直徑的神經突中,也可以很好地重建血影蛋白的三維分布(圖3f-j)。 圖4 DMO-PSF原理及成像效果 ? ? ? ?大視場成像也帶來了數據通量的提升。得益于高通量成像的能力,研究人員利用 FD-DeepLoc可以在短時間內采集到上百個不經過人工挑選的全細胞線粒體超分辨圖像。如圖5所示,研究人員在16個感興趣的視場區域,利用FD-DeepLoc重建出121個全細胞線粒體三維超分辨圖像(圖5a)。通過提取這些細胞的形態(分叉、長度、球形度等)進行聚類分析,得到三種不同類型的線粒體細胞。如圖5b所示,類型1細胞包含更多的小圓形線粒體和更少的分支結構;類型2細胞包含延伸的管狀線粒體和更復雜的網絡結構;類型3細胞含有球形和管狀線粒體的混合物結構。精細的全細胞結構超分辨分析為細胞組學提供了新思路。 圖5 全細胞三維超分辨線粒體圖像的定量分析。比例尺,50 μm(a),10 μm(b1) ? ? ? ?綜上所述,該團隊提出了一種可以對空間移變PSF進行精確定位的深度學習算法,結合GPU加速的矢量PSF擬合算法對大視場像差進行快速精準建模和基于可變形鏡調制的DMO?PSF自由景深控制,實現了三維全細胞大視場高通量超分辨成像。相比于傳統基于散光的三維SMLM成像,FD-DeepLoc將SMLM的成像通量提高了約100倍,充分利用sCMOS的全畫幅面陣實現高保真的生物結構重建和高精度體積成像。該工作無需復雜的硬件自動化即可將SMLM從低通量技術轉變為高通量成像技術,使大尺寸樣品的體積三維超分辨成像成為可能,這有助于生物學研究中罕見結構或事件的發現,并提高生物學研究中的定量統計分析能力。未來可利用最新更大面陣的sCMOS相機,對進一步提升超分辨成像的通量至毫米級尺寸,可為腦切片、病理樣品和類器官等大尺寸樣品成像提供新的技術手段,使研究人員在大尺寸厚樣品原位解析生物大分子結構的同時分析細胞種群間的微小差異,為結構生物學、細胞生物學的研究提供新視角。 ? ? ? ?南方科技大學生物醫學工程系的李依明副教授為該論文的通訊作者,在讀博士生傅爽和石偉為論文的共同一作,南方科技大學為第一通訊單位。該項目得到了山東省重點研發計劃,深圳市孔雀團隊和南方科技大學啟動資金等科研項目的支持。 原文鏈接:https://www.nature.com/articles/s41592-023-01775-5 參考文獻: 1. Li, Y. et al. Global fitting for high-accuracy multi-channel single-molecule localization. Nat. Commun. 13, 3133 (2022). 2.Li, Y. et al. Real-time 3D single-molecule localization using experimental point spread functions. Nat. Methods 15, 367–369 (2018). 3.Speiser, A. et al. Deep learning enables fast and dense single-molecule localization with high accuracy. Nat. Methods 18, 1082–1090 (2021). 4.Fu, S. et al. Deformable mirror based optimal PSF engineering for 3D super-resolution imaging. Opt. Lett. 47, 3031 (2022). 撰文:石偉,傅爽 審核修改:李依明 作者簡介: 李依明,南方科技大學研究員,2009、2010、2015年分別于上海交通大學、海德堡大學、卡爾斯魯厄理工學院獲得生物醫學工程學士、醫學物理碩士和生物物理博士學位。2016-2019年受瑪麗居里博士后獎學金資助,分別在歐洲分子生物實驗室和耶魯大學任職博士后和訪問學者。長期致力于研究三維超高分辨顯微成像技術及其生物應用,在光學儀器研發,光學理論和成像算法等方面均有一定的積累,近五年來發表高影響力論文13篇,其中第一/通訊作者論文7篇,包括Nature Methods(2篇),Nature Communications(1篇),Optics Letters(3篇)等。入選“深圳市海外高層次人才B類”,目前和包括來自EMBL,耶魯大學,牛津大學和劍橋大學等多個實驗室有合作關系。課題組長期招收博士后、研究助理及博士/碩士研究生,有物理,光學工程、計算機、機械工程、生物醫學工程、生物技術、生物化學等相關專業背景,要求具備良好的學習能力、獨立工作能力和團隊溝通能力。 課題組主頁:https://li-lab-sustech.github.io/ 有意者請將個人簡歷發送至李依明副教授郵箱:liym2019@sustech.edu.cn。 研究團隊人員合影(通訊作者前排中間,共同一作前排左4和前排右1)